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Resolução de problemas de PCR e amplificação RT-PCR
| Problema | Possível causa |
|---|---|
| Sem bandas no gel | O tempo de extensão era muito curto |
| O termociclador não estava na temperatura correta | |
| Bandas extras inespecíficas em gel | Primers hibridizados em um site secundário no template |
| A contaminação de DNA foi introduzida em primers ou buffers |
- O que causa a falha de PCR?
- Como você resolve um problema de PCR?
- O que você faria se a amplificação por PCR de uma amostra falhou?
- O que acontece quando você adiciona muito primer ao PCR?
O que causa a falha de PCR?
Normalmente, a primeira coisa que os pesquisadores fazem é culpar uma enzima ou reagente defeituoso quando um experimento falha, mas com o PCR é menos provável que seja a causa do fracasso. Mais frequentemente, problemas internos mais profundos, como design de primer, parâmetros de termociclador ou ligação não específica a outras sequências de modelo são a causa.
Como você resolve um problema de PCR?
Verifique a capacidade de comprimento de amplificação das polimerases de DNA selecionadas. Use DNA polimerases especialmente projetadas para PCR longo. Escolha DNA polimerases com alta processabilidade, que podem amplificar alvos longos em um tempo mais curto. Reduza as temperaturas de recozimento e extensão para ajudar na ligação do primer e termoestabilidade da enzima.
O que você faria se a amplificação por PCR de uma amostra falhou?
Se uma reação de amplificação falhar e você suspeitar que o modelo de DNA está contaminado com um inibidor, adicione a preparação de DNA suspeita a uma reação de controle com um modelo de DNA e um par de primer que tenha amplificado bem no passado .
O que acontece quando você adiciona muito primer ao PCR?
O uso de concentrações mais altas de primers pode ter os seguintes efeitos: Se os primers são capazes de formar dímeros, aumentar sua concentração apenas resulta na criação de primers-dímeros e não melhora a amplificação do produto de PCR desejado.
