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Em vez disso, as condições de PCR precisarão ser otimizadas; considere o seguinte ao ajustar as condições de PCR:
- Reduza a quantidade de modelo.
- Aumente a temperatura de recozimento.
- Use PCR touchdown.
- Reduza o número de ciclos de PCR.
- Redesenhar os primers.
- Use primers aninhados.
- Amplificar novamente o produto.
- Por que meu PCR não está funcionando?
- Como você otimiza as condições de PCR?
- O que causa manchas no PCR?
- Como saber se o PCR está contaminado?
Por que meu PCR não está funcionando?
O esquecimento de apenas um componente da reação de PCR, seja a DNA polimerase, os primers ou mesmo o DNA molde, resultará em uma reação malsucedida. A solução mais simples é repetir a reação. ... Se ainda não houver produto de PCR depois disso, é provável que haja algo mais impedindo sua reação.
Como você otimiza as condições de PCR?
Condições de PCR
- Use temperaturas de desnaturação mais altas (e.g., 98 ° C em oposição a 94 ° C ou 95 ° C) para permitir a desnaturação completa do molde.
- Mantenha os tempos de recozimento para modelos ricos em GC o mais curto possível.
- Use primers com um T mais altom (>68 ° C), porque o recozimento pode ocorrer a uma temperatura mais alta.
O que causa manchas no PCR?
Contaminação de DNA, RNA na amostra de DNA, alta concentração de DNA na reação de PCR pode causar manchas. ... Mancha de DNA geralmente causada em plantas devido à alta concentração de DNA modelo.
Como saber se o PCR está contaminado?
Para verificar se há contaminação da solução, monte as reações de controle negativo usando novos reagentes sabidamente não contaminados e adicione uma das soluções suspeitas a cada reação. Essa reação mostra que produtos amplificados indicativos de contaminação são evidências de que a solução adicionada estava contaminada.
